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Compétences techniques

CRYOFRACTURE et visualisation d'une réplique au microscope électronique en transmission

Cryofracture : technique de congélation qui permet d'observer la structure d'échantillons fluides à l'échelle du nanomètre.

LA CRYOFRACTURE

Cristal liquide

Réplique d'un cristal liquide thermotrope (en phase smectique B7) observé au microscope électronique en transmission.

La cryofracture est un procédé qui permet l'observation d'échantillons originellement fluides au microscope électronique, c'est-à-dire à une échelle nanométrique. Le microscope électronique en transmission (MET) fonctionne sous vide, pour être observer les échantillons fluides doivent être préalablement préparés. Ces échantillons fluides peuvent être des gels, des dispersions colloïdales de façon générale (émulsions, suspensions solides, ou tout système organisé à une échelle comprise entre 1 nanomètre et 100 micromètres) ou encore des phases organisées de tensioactifs ou bien des cellules biologiques. Cette technique est une des seules qui permettent de visualiser dans l'espace direct la structure de phases fluides à l'échelle du nanomètre. Il est par exemple possible de localiser des protéines présentes dans les couches lipidiques d'une membrane cellulaire, de détecter les défauts caractéristiques présents dans des phases cristal liquides, d'observer la répartition spatiale de colloïdes dans des fluides organisés ou encore de connaître la structure interne de particules colloïdales (présence d'une organisation interne, différencier un colloïde « plein » d'un colloïde vide etc ...).

PROCÉDÉ
Table porte-échantillon

Table porte-échantillon

figure 1a

Figure 1a

figure 1b

Figure 1b

Un très faible volume de l'échantillon (environ 1µL) est posé sur une plaquette porte-objet en cuivre (d'une surface d'environ 1 mm2). Une plaquette identique est alors disposée sur cette goutte d'échantillon de façon à créer un « sandwich » d'échantillon d'une épaisseur de l'ordre de 20 micromètres (figure 1a ci-contre). Les plaquettes sont préalablement traitées pour que l'échantillon mouille correctement la surface. Cet ensemble est ensuite plongé brusquement dans un bain de propane liquide (de température environ égale à -200°C). Cette congélation ultrarapide permet en principe de préserver l'organisation interne de l'échantillon, les molécules constituant la phase fluide n'ayant, normalement, pas le temps de cristalliser comme elles le feraient si la température était diminuée progressivement. Le but recherché est une vitrification de l'échantillon. L'ensemble plaquettes/échantillon est ensuite introduit dans la table porte-échantillon, dans l'enceinte de l'appareil de cryofracture maintenue à une pression très faible (environ 10-6 mBar) et toujours à une température de -200°C. Les deux plaquettes de cuivre sont alors séparées de manière mécanique comme schématisée sur la figure 1b. La table porte-échantillon s'ouvre, séparant les deux plaquettes de cuivre : la plaquette supérieure est imbriquée dans la partie mobile du porte-échantillon et la plaquette inférieure est maintenue dans la partie fixe.

figure 2

Figure 2. Ligne de fracture (en rouge) dans une suspension colloïdale.

L'échantillon est alors fracturé. La ligne de fracture passe par les zones de moindre résistance, séparant l'échantillon en deux parties. Ces zones de faibles cohésions sont, par exemple, la zone hydrophobe d'une couche lipidique dans le cas d'une membrane ou bien la surface de contact entre les particules colloïdales et le solvant environnant (Figure 2).

figure 3

Figure 3. Projection du mélange platine-carbone à 45° sur la surface fracturée de l'échantillon.



Un alliage de platine et de carbone est chauffé dans un canon afin d'obtenir un gaz de particules. Simultanément, il est projeté par le canon sur la surface fracturée, avec un angle de 45°. Ainsi, le métal se dépose avec une épaisseur caractéristique qui varie selon le relief de la surface (Figure 3). Ce procédé permet d'obtenir une réplique de la surface.

figure 4

Figure 4. Projection du carbone à un angle de 90°.


Un deuxième canon dépose une couche uniforme de carbone, avec un angle de 90°, afin d'augmenter la résistance mécanique de la réplique de la surface fracturée (Figure 4).

figure 5

Figure 5. Étape de nettoyage de la réplique.

L'ensemble constitué de l'échantillon couvert de sa réplique de platine-carbone et de carbone est ensuite ramené à température et pression ambiante, nettoyé dans un solvant adapté et déposé sur une grille de microscopie électronique. La réplique ainsi préparée, est observée au microscope électronique en transmission (figure 5). La finesse des grains de platine-carbone fixe la résolution de l'image, elle est de l'ordre de 5 nm.

LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE EN TRANSMISSION.

figure 6

Figure 6. Schéma de l'étape d'observation au microscope électronique en transmission.

L'image de la surface est obtenue grâce à un faisceau d'électrons projeté verticalement sur la réplique. Le carbone est traversé par les électrons alors que le platine les arrête de façon plus ou moins totale selon l'épaisseur rencontrée par le faisceau. Un film photographique situé sous l'échantillon, permet de retranscrire les informations sur le relief en contraste de gris : les zones de la réplique où le platine s'est accumulé apparaissent en noir, les zones sans platine sont blanches et les zones sans relief sont grises car le platine s'y est réparti uniformément (figure 6). L'analyse précise de l'image est parfois complexe car il s'agit ici d'une coupe bidimensionnelle dans un échantillon tridimensionnel. Cependant dans bien des cas, elle permet d'obtenir de précieuses informations sur la structure de l'échantillon.

QUELQUES PHOTOS

Appareil de cryofracture


Appareil de cryofracture

Intérieur de l'enceinte de l'appareil de cryofracture


Intérieur de l'enceinte de l'appareil de cryofracture



Phase lamellaire


Cliché de microscopie électronique après cryofracture d'une solution aqueuse de tensioactifs organisée en phase lamellaire.



Phase hexagonale


Cliché de microscopie électronique après cryofracture d'une solution aqueuse de tensioactifs organisée en phase hexagonale (échelle 50 nm).

UTILISATION

Plusieurs résultats scientifiques ont été obtenus grâce, entre autres, à l'utilisation de ces techniques.

Cette technique délicate de par la complexité des manipulations et des nombreux artefacts qu'elles peuvent engendrer permet toutefois de visualiser directement l'organisation d'échantillons fluides. La cryofracture est utilisée en complément d'autres techniques de caractérisation telles que la diffusion des rayons X, des neutrons ou de la lumière.
Les échantillons pouvant être analysés sont très variés, à titre d'exemple, on peut citer : les gels, les dispersions colloïdales, les tensioactifs, les cristaux liquides, les cellules biologiques,...

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